Académie Suisse du vin

Le resveratrol polyvalent

LE RESVERATROL DU VIN: UNE MOLÉCULE ANTI-CANCÉREUSE

Il arrive que certaines molécules biologiques, de découverte récente, se révèlent aussi polyvalentes que bénéfiques. La raison en est parfois simplement que leur action au niveau des réactions biochimiques a des conséquences multiples.

Le Professeur Norbert LATRUFFE, du Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire de l‘Université de Bourgogne-Dijon, nous fait l‘honneur de nous présenter le résultat de ses recherches.

« Une consommation modérée de vin nous protégerait-elle de l‘apparition de cancers ? S‘agitil d‘une nouvelle facette du « French paradox »? Les premières recherches sur cette hypothèse pourraient aller dans ce sens. Les propriétés de l‘une de ces substances intéresse particulièrement les chercheurs: le resvératrol, qui apparaît être un des composants les plus actifs. Décidément, le vin n‘a pas fini de nous étonner.

L‘intérêt de la problématique

En se protégeant contre les agressions extérieures, la vigne nous protégeait-elle de certains cancers? Au départ de cette piste séduisante, c‘est l‘analogie avec les conclusions célèbres du French paradox concernant la protection vasculaire: les buveurs de vins modérés et réguliers sont moins sujets aux cancers que les abstinents. Les études épidémiologiques révèlent pour ce type de maladies la même courbe en J que pour les maladies cardio-vasculaires: une baisse significative pour 2 ou 3 verres par jour, par contre suivie d‘une augmentation rapide de la mortalité pour une plus forte consommation. Le passage à des études sur des animaux de laboratoire, menées notamment à l‘Université Californie, ont apporté un début de confirmation: les chercheurs constataient un moindre développement de tumeurs cancéreuses chez des souris auxquelles on avait ajouté un extrait solide de vin (sans alcool) par rapport à un groupe témoin. En 1997, des travaux au départ sans rapport avec les recherches effectuées sur le vin ont ouvert aux scientifiques un nouveau champ d‘investigation: en recherchant des molécules anti-cancéreuses dans des extraits de plantes, I‘équipe du Dr Pezzuto à Chicago, a montré l‘action bénéfique d‘un polyphénol, le resvératrol, présent dans plusieurs fruits et légumes. De toutes les plantes testées pour leur activité chimiopréventive anti-cancer et de tous les composés examinés, celui-ci est le plus prometteur. Ces études montraient que le resvératrol inhibe, en laboratoire, des étapes majeures du développement des cellules cancéreuses. Or cette molécule est présente dans les raisins et se retrouve dans le vin… Sorte de fongicide naturel, le resvératrol est produit par la vigne lorsqu‘elle est attaquée par Botrytis cinerera, un champignon microscopique entraînant une pourriture grise du raisin (« pourriture noble »), et plus généralement lorsqu‘elle subit un stress, comme un effeuillage. Le colloque « sang et vin », qui s‘est déroulé à Bordeaux en avril 2001 a de nouveau mis en lumière tout l‘intérêt que la communauté scientifique porte à cette molécule. Lors de ce colloque, le Dr Raul de Strasbourg, a présenté les résultats d‘une étude in vitro sur des cellules cancéreuses humaines et in vivo sur des souris: l‘administration de 0,01% de resvératrol dans l‘eau de boisson pendant 7 semaines chez des souris inhibe à 70% la formation de tumeurs dans l‘intestin grêle. De notre côté, au Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire de l‘Université de Bourgogne nous avons montré que le resvératrol agit sur plusieurs cibles du cycle cellulaire en inhibant la croissance tumorale. Ces études ont été menées in vitro sur des cellules cancéreuses humaines de foie et de colon. Là encore les résultats ont été significatifs. A une certaine dose, le résveratrol provoque même un « suicide » de cellules cancéreuses colorectales (apoptose).

A propos, qu‘est-ce que le resvératrol?

Le resvératrol est un polyphénol présent dans certains fruits (mûres, arachides… et surtout raisins) Chez la vigne il est synthétisé dans la pellicule de raisin, et de ce fait, retrouvé dans les vins rouges, particulièrement dans le pinot noir de Bourgogne (Jeandet et coll., 1991) (figure 1). Cette molécule a été découverte en 1940 par un chercheur japonais. Sa structure a été établie par les anglais Langcake et Pryce en 1977. Il s‘agit du 3,5,4‘-trihydroxystilbène où l‘isomère trans, majoritaire, est la forme active.

Le trans-resvératrol a des propriétés spectroscopiques en ultraviolet et de fluorescence caractéristiques. C‘est une molécule photosensible qui, par exposition à la lumière ou un autre rayonnement, se transforme irréversiblement en isomère cis. Le resvératrol est aussi une phytoallexine de la vigne (réaction de défense de la plante) et qui est produit (Jeandet et coll., 1991) en abondance en réponse à une infection par un micro-organisme, Bothrytis cinerea (Jeandet et coll., 1995). Des études épidémiologiques (St Leger et coll., 1979) ainsi que des travaux expérimentaux ont montré une corrélation entre la consommation modérée de vin et la prévention des accidents cardiovasculaires. Dans ce processus, le resvératrol aurait, par ses propriétés antithrombiques, un rôle d‘inhibition de l‘agrégation plaquettaire (Chung et coll., 1992) ou antioxydant vis-à-vis des lipoprotéines et de la paroi vasculaire (Siemann et coll., 1992). (Tableau I) Depuis l‘étude épidémiologique de Renaud et coll (1998) mettant en évidence une réduction de 21 % de la mortalité par cancer parmi une population de buveurs modérés de vin, plusieurs études expérimentales concourent en faveur d‘un rôle chimiopréventif de polyphénols du vin et en particulier du resvératrol vis-à-vis de cancers. (Surh et coll., 1999; Tomera et coll., 1999; Fremont et coll. 2000).

Propriétés antiprolifératives du resvératrol

Parmi les avancées récentes, il protège les souris vis-à-vis d‘un cancérigène chimique, le DMBA (7,11 diméthylbenzanthracène), qui provoque chez l‘animal des tumeurs mammaires, de la peau ou des leucémies (Jang et coll., 1997). Il a été aussi montré que le resvératrol était: un inhibiteur de la ribonucléotide réductase, enzyme impliquée dans la synthèse des ribonucléotides, donc en relation avec les acides nucléiques (Fontecave et coll., 1998), un inhibiteur de cellules MCF-7 mammaires en culture (Mgbonyebi et coll., 1998) et un activateur du récepteur aux oestrogènes, quoique à une forte concentration (Gehn et coll., 1997). Il a été aussi rapporté que le resvératrol exerce un effet anti-prolifératif sur des cellules de cancer de colon (Schneider et coll. 2000). Par ailleurs, le resvératrol est un antagoniste de la dioxine, molécule bien connue, responsable d‘effets délétères sur la santé, notamment de cancers (Cesper et coll., 1999). Certains dérivés du resvératrol comme la viniférine (dimère de resvératrol) sont rapportés pour avoir également des propriétés anti-tumorales sur de nombreux modèles cellulaires (Ohyama et coll., 1999). Cependant les données de la littérature restent fragmentaires et quelquefois contradictoires aussi bien dans le domaine du cardio-vasculaire (Turrens et coll., 1999) que celui du cancer (Soleas et coll., 1997). Des auteurs viennent de montrer que le trans-resvératrol inhibe la prolifération des myofibroblastes de foie humain en culture (Godichaud et coll., 2000), impliqués dans la progression du cancer au niveau de cet organe. Ces résultats convergents sur deux types de cellules hépatiques (épithéliales et fibroblastiques) renforcent l‘hypothèse d‘un effet préventif du resvératrol vis-à-vis des cancers hépatiques (Delmas et coll., 2000). Enfin, une action du resvératrol vient d‘être mise en évidence en tant qu‘inhibiteur de la NO synthase inductible, une enzyme impliquée dans un processus d‘initiation tumorale (Chang et coll., 2000).

Le but de notre travail est de connaître la capacité du resvératrol à inhiber la prolifération de lignées cellulaires dérivées d‘hépatocytes étant donné qu‘un hépatocarcinome est l‘une des tumeurs malignes les plus courantes et l‘une des causes principales de décès par cirrhose du foie et que celui-ci est l‘organe essentiel de transformation des nutriments et des xénobiotiques. Si l‘effet antiprolifératif du resvératrol, avait été décrit pour de nombreux types cellulaires, l‘action de ce polyphénol du vin sur les cellules hépatiques n‘avait pas encore été étudiée.

En 2000, nos travaux ont mis en évidence pour la première fois un effet inhibiteur du resvératrol, dépendant de la dose et du temps, sur la prolifération de cellules hépatiques d‘origine tumorale humaines (Delmas et coll., 2000).

Nous avons donc comparé l‘effet du resvératrol sur des lignées d‘hépatome de deux espèces; les cellules Fao d‘hépatome de rat d‘une part, et les cellules HepG2 d‘hépatoblastome humain d‘autre part. Nos résultats montrent que le resvératrol entraîne une diminution de la vitesse de prolifération des deux types cellulaires en fonction du temps (à partir de 24 heures) et de la concentration de la molécule (gamme du micromolaire). Après 48 heures de traitement avec le resvératrol dans l‘éthanol 0, 1%, la concentration nécessaire pour obtenir 50% d‘inhibition est plus faible dans les cellules Fao (8 LM) que dans les cellules HepG2 (14 LM). La présence d‘éthanol a un effet potentialisant. Les tests de toxicité montrent que le seuil est plus faible avec Fao qu‘avec HepG2. Les concentrations de resvératrol supérieures à 50 LM entraînent une lyse cellulaire importante mise en évidence par une augmentation de la lactate déshydrogénase extracellulaire. A 30 LM, l‘inhibition de la croissance des cellules en culture est réversible si le resvératrol est retiré après 48 heures de traitement avec les cellules HepG2, à partir de 24h avec les cellules Fao. L‘étude des niveaux d‘inhibition par le resvératrol a été recherché et les résultats montrent que la synthèse d‘ADN (incorporation de thymidine-tritiée) n‘est pas inhibée et qu‘il y a une accumulation de cellules dans les phases S et G2-M du cycle cellulaire (études en cytométrie en flux).

En résumé, le resvératrol, associé ou non à l‘alcool, inhibe in vitro la prolifération de cellules hépatiques tumorales, probablement en retardant ou en bloquant les mitoses. (Delmas (a) et coll., 2000). Actuellement nous recherchons le mode d‘action du resvératrol sur l‘expression de gènes cibles impliqués dans la prolifération cellulaire à deux niveaux: – étude du mécanisme responsable de l‘effet anti-prolifératif du resvératrol dans les hépatomes mais aussi sur d‘autres lignées de cellules cancéreuses humaines, en particulier colorectales en fonction des doses utilisées; – recherche si des processus d‘apoptose sont mis en jeu, si oui, en étudier la sensibilité vis-à-vis du type cellulaire. Des résultats préliminaires ont mis en évidence une forte inhibition de la prolifération d‘une lignée cellulaire de cancer colorectal par le resvératrol associé à un processus d‘apoptose (Delmas(b) et coll., 2000) (figure 2).

Bio-absorption du resvératrol

Si le rôle bénéfique pour la santé de substances naturelles telles que des microconstituants d‘aliments ou de boissons est fréquemment avancé, c‘est très souvent en raison de preuves indirectes (études épidémiologiques) ou à partir d‘effets biologiques sur des systèmes in vitro voire chez des animaux de laboratoire. Dans ces dernières approches, il s‘agit souvent de doses pharmacologiques. Il est clair que si l‘on veut prouver des effets protecteurs de produits naturels aussi bien au niveau cardio-vasculaire que contre le cancer, il est non seulement indispensable d‘élucider le mode d‘action sur les cibles cellulaires mais aussi connaître les mécanismes d‘absorption et de biodisponibilité de ces composés considérés comme bioactifs, ce qui permettra alors de comparer les concentrations circulantes ou intracellulaires aux doses effectrices. Aussi ces processus de bioabsorption sont en général très mal connus parce que peu étudiés souvent en raison des difficultés techniques de séparation, de détection et de suivi de leur biotransformation. Dans le cas de polyphénols du vin de la famille des stilbènes, en particulier du resvératrol et de ses dérivés, l‘obtention du trans-resvératrol radiomarqué comme traceur va nous permettre de répondre à ces questions.

La recherche d‘une corrélation éventuelle entre les effets bénéfiques d‘une consommation modérée de vin et les effets du resvératrol, décrits dans les systèmes in vitro est donc une démarche essentielle qui passe par l‘établissement du rapport entre le taux de resvératrol plasmatique et la quantité réellement absorbée par les cellules. A ce jour, aucune preuve biochimique n‘étaye solidement cette hypothèse. Actuellement, celle-ci est peu connue mis à part quelques études montrant sa pénétration dans les cellules (Blache et coll., 1997) ou encore que sa concentration plasmatique chez le rat serait compatible avec ses effets biologiques au niveau du foie (Bertelli et coll., 1998). Les connaissances générales sur la biodisponibilité des polyphénols sont regroupées dans une récente revue bibliographique (Scalbert & Williamson, 2000). En ce qui concerne le resvératrol en particulier, il vient d‘être montré qu‘il est absorbé au niveau de l‘intestin grêle de rat essentiellement sous forme de glucuronide (Kuhnle et coll., 2000; Andlauer et coll., 2000). Concernant les conjugaisons, à signaler que la forme majoritaire du resvératrol des graines d‘arachide est le dérivé glucosylé, appelé encore picéide (Ibern-Gomez et coll., 2000). Dans le but d‘étudier la bioabsorption du resvératrol et de dérivés présents dans le vin (seuls ou associés) par les cellules choisies en raison de leur rôle physiologique (foie, intestin, vaisseaux) en relation ou non avec la présence d‘éthanol nous avons tout d‘abord étudié par chromatographie d‘exclusion les interactions du resvératrol avec des protéines plasmatiques. Il est apparu que le resvératrol interagit avec des protéines sériques, notamment l‘albumine sur laquelle la fixation au niveau de plusieurs sites semble favorisée par la présence d‘acides gras sur la protéine. Dautre part, la captation du resvératrol par deux types cellulaires différents (cellules d‘origine hépatique, la lignée HepG2, issue d‘hépatoblastome humain et cellules tumorales colorectales humaines SW 480) a été étudiée en fonction du temps. Après extraction du resvératrol des milieux de culture sur micro-colonne de type SepPak C18 et quantification par CLHP, nous avons mis en évidence un influx du resvératrol dans les cellules HepG2 supérieur à celui que l‘on peut mesurer dans les cellules SW 480. Ces résultats préliminaires suggèrent un tropisme préférentiel pour le foie et, corrélés avec nos études in vitro montrant une inhibition de la prolifération de cellules d‘hépatomes par le resvératrol, ils constituent un argument en faveur d‘un possible rôle protecteur du resvératrol d‘origine alimentaire (Jannin et coll., 2001).

Futures directions

Concernant la prévention anticancéreuse, à l‘instar de la recherche sur les maladies cardio-vasculaires, c‘est le passage à la recherche sur l‘homme in vivo qui reste problématique, pour des raisons éthiques, mais aussi en raison des notions de bio-disponibilité et de bio-absorption propre à l‘organisme humain. « Dans quelle mesure la molécule de resvératrol se retrouve dans les cellules, c‘est la question qu‘il faut donc élucider. Sans compter les sensibilités génétiques individuelles qui peuvent modifier la donne. Un autre élément incite les chercheurs à la prudence: il s‘agit là principalement d‘études sur une substance isolée. La complexité du vin n‘autorise pas les raccourcis. Complexité de l‘organisme humain, complexité du vin, si les premiers éléments de recherches incitent à l‘optimisme, ils doivent encore être confirmés dans les années à venir.

BIOGRAPHIE

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Note de la rédaction

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Remerciements

Je remercie tout particulièrement l‘équipe resvératrol du LBMC, notamment Brigitte Jannin et Dominique Delmas, ainsi que Jean-Pierre Berlot, Mustapha Cherkaoui Malki, Patricia Passilly- Degrace et les stagiaires du laboratoire.

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