Académie Suisse du vin

Caractérisation des cépages dans les vins

L‘auteur, le Professeur M.-H. MERLE, du Laboratoire DGCCRF à Montpellier, a présenté ce texte à Adelaide à l‘occasion du 26e Congrès de l‘OIV. Cet article est issu du travail de thèse de René SIRET (thèse soutenue le 11 janvier 2001). Ce travail a fait l‘objet d‘une collaboration entre la DGCCRF, l‘INRA, le Centre OEnologique de la Faculté de Pharmacie de Montpellier et l‘ONIVINS.

I - INTRODUCTION GÉNÉRALE

Le but de cette étude est de certifier de l‘authenticité des cépages utilisés spécialement dans le cas des vins cépage.

Garantir l‘identité des cépages dans les vins intéresse:

• le consommateur qui y trouve un critère de qualité, facteur essentiel du plaisir du dégustateur;
• le producteur qui y trouve aussi un critère de qualité. Notion fondamentale dans le cadre des enjeux commerciaux auxquels sont soumis les producteurs. Garantir l‘identité des cépages apporte au producteur une certitude de traçabilité indispensable dans le temps présent ;
• les services de contrôle sont également intéressés par cette garantie de l‘identité des cépages.

Il s‘agit pour eux d‘un outil précieux dans la recherche de la protection et de la sécurité des consommateurs. De même dans la prévention dans la lutte contre les fraudes, pour garantir la loyauté et l‘équilibre du marché, les services de contrôle ont besoin d‘un tel outil. Par définition les vins de monocépage sont élaborés à partir d‘une seule variété de vigne. La notion de vin de cépage est un concept né aux Etats-Unis d‘Amérique. Ils s‘agit de vins de plus en plus appréciés. Les vins sont francs, caractéristiques du raisin dont ils sont issus. Le cépage a une grande influence sur la qualité et la valeur du produit final. Nous avons cherché à développer une méthode permettant d‘identifier directement le cépage dans les vins commerciaux.

La méthode devait être:

• Rapide: permettant une analyse en routine.
• Robuste: indépendante des techniques de vinification et d‘élaboration des vins.
• Indépendante des régions de production.
• Discriminante: tenant compte de la grande diversité de l‘espèce Vitis vinifera L.
• Performante et sélective: tenant compte de la complexité physicochimique du vin.

En ce qui concerne sa composition le jus de raisin fermenté comporte plusieurs centaines de composés.

Certains sont spécifiques d‘un groupe de cépages, mais la plupart se retrouvent dans tous les vins. La composition du vin est influencée par les conditions de culture, de vinification et par les traitements oenologiques. Pour la caractérisation des cépages dont sont issus les vins, la méthode retenue aurait pu s‘appuyer sur différents composés du vin :

• les éléments minéraux,
• les éléments isotopiques,
• les composés volatils,
• les peptides ou les protéines.

Mais l‘étude de chacune de ces familles de composés présente de limites dans le domaine où nous travaillons. La teneur des éléments minéraux est influencée non seulement par la nature du cépage mais aussi par la zone géographique où le vin est produit. Les éléments isotopiques sont aussi liés à l‘origine géographique des vins.

Les composés volatils, souvent difficiles à caractériser et à quantifier, peuvent varier en fonction de la durée de conservation des vins. Les protéines, les composés phénoliques également peuvent varier suivant le type de vinification et au cours de la vinification. Aussi la méthode choisie est une méthode moléculaire qui repose sur la caractérisation de l‘ADN: l‘acide Désoxyribonucléique.

L‘ADN est spécifique des cépages, indépendant des conditions de culture. De plus, il existe des techniques d‘analyse spécifiques pour caractériser l‘ADN. La recherche, la caractérisation de l‘ADN sont couramment utilisées dans l‘agro-alimentaire pour identifier les différentes espèces animales ou végétales, dans les produits transformés. Il existe dans la littérature de nombreux exemples de conditions expérimentales pour des matrices dites difficiles. Plusieurs techniques de marquage moléculaire sont actuellement disponibles. Leur utilisation dépend du degré d‘information que l‘on souhaite obtenir en analysant l‘ADN de l‘organisme à étudier.

Les marqueurs RFCP

Restriction Fragment Length Polymorphism sont des enzymes de restriction qui coupent l‘ADN au niveau de sites de restriction spécifiques.

Les marqueurs RAPD

Random Amplified Polymorphy DNA sont essentiellement utilisés pour le polymorphisme d‘amplification qu‘ils peuvent générer.

Les marqueurs microsatellites sont constitués de répétitions de tandem de motifs mono, di, tri ou tetra nucléotidiques. Les plus courants: ‘(A)n, (TC)n, (TAT)n‘, (GATA)n. n: de quelques unités à plusieurs dizaines. L‘intérêt de ces marqueurs réside dans le fait qu‘ils sont très polymorphes. Ce polymorphisme d‘unités de répétition est révélé par amplification par PCR à l‘aide d‘amorces spécifiques d‘un locus donné et par séparation des fragments amplifiés sur gels de polyacrylamide. D‘autre part les microsatellites sont spécifiques de l‘espèce à partir de laquelle ils ont été définis. Il faut aussi noter qu‘il existe divers types de marqueurs microsatellites.

Les marqueurs microsatellites nucléaires:

• très polymorphes et qui existent en une seule copie dans le génome.

Les marqueurs microsatellites chloroplastiques:

• moins polymorphes, moins présents en de nombreuses copies dans la cellule.

II – ÉTUDE EXPÉRIMENTALE

En commençant notre étude, plusieurs questions se sont posées à nous:

1. Est-il possible, à l‘aide de marqueurs microsatellites, de différencier les cépages de l‘espèce Vitis vinifera L.?
2. Comment évolue l‘ADN au cours de la fermentation ? Reste-t-il de l‘ADN dans les vins bruts?
3. Est-il possible de caractériser des mélanges d‘ADN dans les vins bruts?
4. Est-il possible d‘analyser l‘ADN dans des vins finis ou commerciaux?

II. 1 DIFFÉRENCIATION DES CÉPAGES

Pour répondre à la première question: Comment différencier les cépages à partir des marqueurs microsatellites.

Notre premier travail a consisté à vérifier l‘identification variétale chez la vigne, à établir une structuration de la diversité génétique de l‘espèce Vitis vinifera L..

A partir d‘une collection ampélographique qui héberge plusieurs milliers de variétés, un échantillon de 44 principaux cépages de Vitis vinifera L. cultivés en France a été constitué. Un deuxième échantillon a été ensuite réalisé portant le nombre d‘individus à 110. Ce deuxième échantillon nous a permis d‘augmenter la diversité des cépages et de diversifier l‘échantillon à l‘échelle mondiale.

Sur ces échantillon nous avons procédé à l‘extraction de l‘ADN à partir des feuilles ou du bois. L‘ADN est extrait en suivant le protocole modifié de Bowers et al. (1993).

Nous avons ensuite procédé à l‘analyse des microsatellites nucléaires. Nous avons dans un premier temps, mis en oeuvre de marqueurs microsatellites. 11 loci microsatellites ont été testés et amplifiés sur l‘ensemble de l‘échantillon des 110 cultivars.

Les amplifications PCR ont été effectuées quelque soit le locus microsatellite à la même température d‘hybridation de 56 °C. Nous avons pu nous assurer de la bonne identité des 110 cépages analysés.

Nous avons également procédé à l‘analyse des microsatellites chloroplastiques. Dix loci microsatellites chloroplastiques ont été employés afin de rechercher un polymorphisme de taille au sein de l‘espèce Vitis vinifera L.. Cette étude a été faite sur les 44 principaux cépages cultivés en France. Comme pour les microsatellites nucléaires la révélation des profils d‘amplification des microsatellites chloroplastiques a été faite sur gel de séquence, après coloration au nitrate d‘argent.

Résultat

L‘amplification PCR de 11 loci microsatellites à partir d‘ADN de vigne provenant de feuille ou de bois n‘a pas posé de problème technique majeur. L‘examen du résultat d‘amplification du locus VVMD25 permet de constater que les profils générés pour ce marqueur microsatellite sont relativement clairs et faciles à lire. On peut noter un phénomène couramment constaté lors de l‘amplification des séquences microsatellite qui serait dû à un dérapage de la polymérase d‘où son appellation « polymérase slippage ». L‘amplification ne produit pas une bande bien individualisée mais plutôt un groupe de bandes proches. Ce problème peut-être minimisé en augmentant la température d‘hybridation de la PCR. Si le problème persiste la bande qui possède la plus forte intensité de coloration est considérée comme étant l‘allèle recherchée.

L‘ensemble des résultats que nous pouvons détailler dans ce document mais qui figure dans la thèse de R. SIRET conforte le choix du type de marqueurs.

Avantage par rapport aux marqueurs type AFLP, RFLP ou RAPD. Pour ce qui est de la caractérisation des vins de cépage par voie moléculaire, nous pouvons dire que les marqueurs microsatellites nucléaires génèrent chez la vigne un polymorphisme important. Ils sont hautement spécifiques.

Les marqueurs microsatellites chloroplastiques révèlent un polymorphisme moins important mais présentent un intérêt pour les matrices difficiles permettant une détection de très petites quantités d‘ADN. Nous pouvons dire qu‘il est possible, à l‘aide de marqueurs microsatellites, de différencier les cépages de l‘espèce Vitis vinifera L.

II. 2 ÉVOLUTION DE L‘ ADN AU COURS DE LA FABRICATION

La partie suivante du travail a consisté à travailler sur des échantillons de moûts et de vins provenant de modèles expérimentaux pour connaître l‘évolution de l‘ADN au cours de la fermentation et pour savoir s‘il reste de l‘ADN dans les vins.

Nous avons procédé par étapes:

1re étape: réaliser des microvinifications en monocépage pour tester les méthodes d‘extraction de l‘ADN appliquée aux moûts et aux vins.

2e étape: réaliser microvinifications effectuées avec des moûts provenant de cépages mélangés.

3e étape: appliquer méthodes d‘extraction et de détection de l‘ADN à la caractérisation des cépages de Vitis vinifera L. dans les vins finis et commercialisés.

Microvinifications et monocépages

Ces microvinifications ont été réalisées en laboratoire. Les microvinifications ont été contrôlées quotidiennement pendant la fermentation alcoolique. La température et la densité ont été ainsi régulièrement notées. Le jus a été traité avec de l‘anhydride sulfureux et ensemencé avec levures.

Six cultivars vinifiés en monocépage: Clairette Blanche, Chardonnay, Grenache noir, Merlot noir, Muscat blanc à petits grains, Syrah.

Microvinifications en cuve de 20 litres

Microvinifications en monocépage.

Ces microvinifications ont été réalisées en laboratoire. Six cultivars ont été vinifiés en monocépage (trois cépage blancs et trois cépages rouges): Clairette blanche, Chardonnay, Muscat blanc à petits grains, Grenache noir, Merlot noir et Syrah.

Les microvinifications réalisées dans des cuves de 20 litres ont été contrôlées quotidiennement pendant la fermentation alcoolique. La température et la densité on été ainsi régulièrement notées. Le moût a été ensemencé avec des levures et le jus traité avec de l‘anhydride sulfureux. Pour suivre l‘évolution de l‘ADN au cours de la fermentation alcoolique des prélèvements quotidiens ont été réalisés. La durée de la fermentation alcoolique, a été variable suivant les cépages: entre 5 et 15 jours. Les vins obtenus présentaient une densité inférieure à 1, des teneurs en sucres réducteurs inférieurs à 1,5 g/l et un titre alcoométrique volumique supérieur a 10,1% vol.

Les analyses ont été réalisées après centrifugation (10 000 g, 20‘, 4°C) d‘un échantillon de 100 ml. Culots (particules en suspension) et surnageants (phases hydro-alcooliques) ont été séparés. Sur les deux parties (culots et surnageants) il a été procédé à l‘extraction de l‘ADN, au dosage de l‘ADN et à la comparaison des profils obtenus à l‘aide des loci VVMD5, VVMD27, VVMD28, VVMD32 et CCMP2 avec la base de données.

L‘analyse de l‘ADN des culots à l‘aide des marqueurs microsatellites nous amène aux conclusions suivantes:

Avec les marqueurs microsatellites nucléaires, l‘amplification de l‘ADN est possible jusqu‘au dernier jour de fermentation pour les six cépages.

Il y a une diminution de l‘intensité de l‘amplification pour les cépages liée à la longueur de la durée de fermentation. Il n‘y a aucune interférence avec l‘ADN d‘autres organismes (levures par exemple).

Avec les marqueurs microsatellites chloroplastiques, l‘amplification de l‘ADN est également possible jusqu‘au dernier jour de la fermentation pour les six cépages. Il n‘y a pas de diminution de l‘intensité de l‘amplification pendant la durée de la fermentation.

L‘analyse de l‘ADN des surnageants à l‘aide des marqueurs microsatellites nous a amené aux conclusions suivantes:

Avec les marqueurs microsatellites nucléaires l‘amplification de l‘ADN est possible jusqu‘au dernier jour de la fermentation alcoolique pour les six cépages.

En conclusion, même si la quantité d‘ADN diminue au cours de la fermentation, il reste de l‘ADN dans les vins bruts. Il est donc possible de caractériser les cépages dans les vins brut

II. 3 CARACTÉRISATION DES MÉLANGES D‘ ADN DANS LES VINS BRUTS

Pour répondre à la question: Est-il possible de caractériser des mélanges d‘ADN dans les vins bruts, nous avons procédé en des microvinifications de mélanges de cépages.

Ces microvinifications ont été réalisées au laboratoire, dans les même conditions que les microvinifications monocepage. Deux types de mélanges de deux cépages ont été réalisés: Chardonnay/Clairette blanche et Syrah/Grenache noir. Différentes proportions de mélanges ont été retenues: 50/50, 70/30 et 90/10.

L‘extraction de l‘ADN a été faite a partir des culots. Dans les surnageants la quantité d‘ADN est trop faible. Suivant les mélanges la durée de fermentation alcoolique a été de 8 à 10 jours. Le dernier jour de la fermentation alcoolique la quantité d‘ADN a été en nette diminution.

Les résultats obtenus permettent de dire que la détection du mélange Chardonnay/Clairette est possible. Jusqu‘au 4e jour de fermentation pour le mélange 90/10. Jusqu‘au 7e jour de fermentation pour le mélange 50/50. Jusqu‘au 8e jour de fermentation pour le mélange 70/30.

L‘allèle du cépage Chardonnay (majoritaire dans le mélange) est visible jusqu‘à la fin de la fermentation alcoolique quelle que soit la composition du mélange.

La détection du mélange Syrah/Grenache noir est possible.

Jusqu‘au 4e jour de fermentation pour le mélange 90/10. Jusqu‘au 7e jour de fermentation pour le mélange 50/50. Jusqu‘au dernier jour de fermentation pour le mélange 70/30.

Il est donc possible de caractériser des mélanges d‘ADN dans les vins bruts.

II. 4 CAS DES VINS FINIS ET DES VINS COMMERCIAUX

Pour répondre à la dernière question: Est-il possible d‘analyser l‘ADN dans des vins finis ou dans les vins trouvés dans le commerce, nous avons disposé de plusieurs types d‘échantillons.

Nous avons utilisé des vins issus de microvinifications, mis en bouteille et conservés au moins six mois. Nous avons également des vins de Syrah élaborés dans un cadre expérimental national par l‘Institut national de la recherche agronomique (INRA).

Enfin nous nous sommes procurés des vins du commerce.

Différentes techniques de préparation et d‘analyses des échantillons ont été mises en oeuvre. En particulier pour les analyses, les amplifications ont été faites à l‘aide des microsatellites nucléaires et à l‘aide du microsatellites chloroplastique CCMP2.

Avec les microsatellites nucléaires, l‘ensemble des analyses confirme le caractère aléatoire de la caractérisation des cépages à l‘aide de ce type de marqueurs. Des amplifications ont été obtenues pour les vins commerciaux avec certaines amorces et pas avec d‘autres.

Lorsque le volume du vin sur lequel l‘extraction est réalisée est inférieur à 100 ml, il n‘y a pas de réponse après amplification.

Quand le volume de vin est compris entre 100 ml et 1 litre, après amplification quelques réponses sont correctes, mais la majorité des réponses reste aléatoire, en raison de bandes supplémentaires ou d‘allèles manquants.

Avec les microsatellites chloroplastiques les résultats sont encourageants avec la paire d‘amorce CCMP2. Nous obtenons une réponse systématique pour les vins testés.

En conclusion, il est difficile d‘analyser l‘ADN de Vitis vinifera L. dans les vins finis ou commerciaux.

III – CONCLUSIONS GÉNÉRALES

L‘ensemble des résultats obtenus est extrêmement encourageant. En effet, il est possible à l‘aide des marqueurs microsatellites de différencier les cépages de l‘espèce Vitis vinifera L.

Les microsatellites nucléaires très polymorphes permettent de différencier les cépages analysés.

Les microsatellites chloroplastiques sont moins polymorphes mais sont des marqueurs plus sensibles aux faibles concentrations d‘ADN.

La quantité d‘ADN diminue au cours de la fermentation alcoolique mais il reste de l‘ADN dans les vins bruts.

La technique microsatellite permet de caractériser les cépages sans interférence des autres types d‘ADN.

Il est possible de caractériser dans un vin brut un mélange, dans des proportions 70/30, de deux cépages.

Pour les vins commerciaux la caractérisation de l‘ADN est très difficile à l‘aide des marqueurs microsatellites nucléaires, mais les marqueurs microsatellites chloroplastiques donnent des réponses positives systématiques.

I V – P E R S P E C T I V E S

Plusieurs pistes de travail existent pour améliorer la caractérisation des cépages dans les vins finis.

Il est possible d‘augmenter le volume de la prise d‘échantillon. Toutefois, cette démarche entraîne une lourdeur d‘analyse pour les grands volumes et nécessite des purifications supplémentaires.

La recherche la plus performante doit consister à mettre en évidence des marqueurs plus sensibles.

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